Experimente

PCR bei Pflanzen und Tieren

Bei Pflanzen: ITS und ETS

ITS_ETS

Wie bei jeder phylogenetischen Untersuchung ist die Qualität der verwendeten molekularen Merkmale entscheidend für die Qualität des rekonstruierten Stammbaums. Nur durch die Analyse einer geeigneten homologen DNA-Sequenz können mit Hilfe der RFLP geeignete makromolekulare Daten für die Stammbaumrekonstruktion gewonnen werden. Die im MoLAB durchgeführten beispielhaften Rekonstruktionen des Stammbaums einiger ausgewählter Angiospermenfamilien erfolgt anhand einer RFLP der Internal Transcribed Spacer-Region (ITS-Region).

Die ITS-Region ist die für phylogenetische Untersuchungen bisher am häufigsten verwendete DNA-Sequenz im Kerngenom. Bei der ITS-Region handelt es sich um eine intergenische, nichtcodierende Region mit hoch variabler Sequenz, sie eignet sich deswegen besonders für die Bestimmung von Verwandtschaftsbeziehungen auf den unteren taxonomischen Niveaus der Arten, Gattungen und Familien.

Da die ITS-Region mehrfach als Genfamilie mit jeweils mehreren hundert- bis tausendfach tandemartig wiederholten Kopien auftritt, ist sie einem einzelnen Kerngen gegenüber stöchiometrisch weit überrepräsentiert und damit für moleku- larphylogenetische Untersuchungen leicht zugänglich. Ein weiterer Vorteil der Verwendung der ITS-Region für molekularphylogenetische Untersuchungen ergibt sich durch ihre Lage.

Die ITS-Region liegt im rRNA-Gencluster. Sie besteht aus zwei Sequenzabschnitten, dem Internal Transcribed Spacer 1 (ITS-1) und dem Internal Transcribed Spacer 2 (ITS-2), die zwischen den hoch konservierten rDNA-Genen 26S, 5,8S und 18S liegen. Durch diese Lage können rDNA-Sequenzabschnitte der hoch konservierten rDNA-Gene als Primer-Sequenzen genutzt werden. Eine Amplifizierung der ITS-1- und ITS-2-Sequenzen mittels PCR ist somit leicht möglich. (KNOOP, 2008)

Bei Tieren: cytb
Basismodul 1.1

mitochondrium

Eines der meist beforschten Gene. In der Lebensmittelüberwachung wird es am häufigsten angewendet. Das Bild zeigt das mitochondriale Gesamtgenom mit den entsprechenden Abschnitten. Die Schülerinnen und Schüler überdenken ein entsprechendes Pipettierschema und wenden jenes an.

LCD-Chip-Technik

Leider nicht mehr durchführbar!

Chipron-Hsbg.001

Mit Hilfe der Fa. Chipron ist das MoLAB erfreulicher Weise in der Lage, diese moderne Technik den Schülerinnen und Schülern als Versuchseinheit anzubieten.

Hier das Funktionsprinzip:

tierspezifische PCR

Was ist in der Wurst?, oder so ähnlich sind die Fragestellungen in der Lebensmittelüberwachung. Wenn die Voruntersuchungen Verdachtsfälle mittels RFLP liefern, werden tierartspezifische Primer verwendet und liefern dann Antworten auf die Frage: Schwein oder Rind.

Restriktionen

Bei diesem Modul kommen verschiedene Restriktionsenzyme zum Einsatz. Eine Kleingruppe von Schülerinnen und Schülern arbeiten hier mit PCR-Amplifikaten des cytb-Gens. Sie müssen ein komplexes Pipettierschema verstehen und anwenden.

DNA-Sequenzierung (hier: Einkapillarsequenzierung)

Die DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül. Bei der Sequenzierung in einem Einkapillarsequenzierer, wie dem ABI Prism 310, kommt die Didesoxymethode nach Sanger zum Einsatz.

Bei dieser Methode werden im PCR-Vorgang nicht nur normale Nukleotide, sondern auch vorliegende Didesoxynukleotide eingebaut. Jene führen zu einem Kettenabbruch, das heißt, dass dieser DNA-Strang nicht mehr verlängert werden kann. Hierdurch entstehen verschieden lange Abschnitte und am Ende sollte jedes Nukleotid des DNA-Moleküls einen Endpunkt darstellen. Somit wandern im Anschluss die kleinsten Moleküle am Schnellsten durch die Kapillare des Sequenzierers. Da die Didesoxynukleotide auch einen Farbanhang besitzen, jedes Nukleotid einen anderen, können sie beim Wandern durch die Kapillare vom Laser detektiert werden. Ein eigens hierfür konzipiertes Programm kann jene Signale nun nach Stärke darstellen. Am Ende erlangt man somit eine genaue Abfolge der Nukleotide im Molekül und kann jene mit Hilfe von Datenbanken wie der NCBI vergleichen, somit den unbekannten Organismus bestimmen.

Real-Time-PCR

Das Prinzip der Real-Time PCR beruht auf der normalen PCR mit Hinzunahme der Quantifizierung durch einen fluoreszenten Reporter. Die Messung erfolgt in Echtzeit, was Schritte wie die Gelelektrophorese in einem Standardverfahren überflüssig macht.

Zusätzlich zu den Standardmaterialien einer PCR wird hierbei noch eine Sonde (Taqman probe) benötigt, die ihre komplementäre Nukleotidabfolge zwischen dem Ort der Primer haben und nicht länger als 20-30 Nukleotide lang sein sollte. Sie trägt an je einem Ende einen Reporter bzw. einen Quencher. Durch die Entfernung zueinander findet zunächst kein Energietransfer statt.

Wenn nun die synthetische Einheit der Taq-Polymerase den Gegenstrang synthetisiert, stößt die Taq-Polymerase auf die Sonde, die anschließend durch die Nuklease-Einheit der Taq-Polymerase hydrolysiert wird. Hierbei entsteht eine räumliche Trennung von Reporter und Quencher und somit ein Fluoreszenzsignal, das proportional zu der Menge des PCR-Produktes zunimmt.

moderne Methoden der Pflanzenvermehrung (Sek I)

Das Arbeiten an der Reinluftbank wird auch im Rahmen des Berufswahlpasses der Stadt Dortmund angeboten. Dazu bieten wir einen Kurs über drei Stunden an, in dem Schülerinnen und Schülern der Klassen 8-10 einen Einblick in die Berufswelt von technischen Assistenten im Laborbereich bekommen. Die Schülerinnen und Schüler können in unserem Labor an einer Sterilbank arbeiten und Orchideen im Reagenzglas vermehren (invitro-Kultur). Sie stellen sterile Nährmedien her und vermehren Orchideen in einer Laborumgebung. Begleitet werden Sie dabei von einer Biologisch-technischen Assistentin.

Donnerstags 10:00 Uhr bis 13:00 Uhr
Termin nach Anmeldung
Teilnehmerzahl 15 Schülerinnen und Schüler
Aus technischen Gründen ist einer größere Anzahl nicht sinnvoll.

Materialien
Arbeitsblätter: Sterilisieren, steriles Arbeiten, Autoklavieren, Nährmedien (Rezepte)